肾移植受者移植前免疫细胞亚群的检测及意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.44.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (44): 7675-7680.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.44.003

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肾移植受者移植前免疫细胞亚群的检测及意义

黎东伟，刘龙山，费继光，王长希

中山大学附属第一医院器官移植中心，广东省广州市 510080

出版日期:2013-10-29 发布日期:2013-10-31
通讯作者: 费继光，博士，教授，硕士生导师，中山大学附属第一医院器官移植中心，广东省广州市 510080 feijg@126.com
作者简介:黎东伟，男，1978年生，广东省佛山市人，汉族，2013年中山大学毕业，硕士，主治医师，主要从事器官移植及普通外科的研究。 totty696@163.com
基金资助:
广东省科技计划项目(2009B030801145)

Detection of immune cell subsets in renal allograft recipients before operation and its significance

Li Dong-wei, Liu Long-shan, Fei Ji-guang, Wang Chang-xi

Department of Transplantation, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Online:2013-10-29 Published:2013-10-31
Contact: Fei Ji-guang, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Transplantation, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China feijg@126.com
About author:Li Dong-wei, Master, Attending physician, Department of Transplantation, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China totty696@163.com
Supported by:
the Scientific and Technological Plan of Guangdong Province, No. 2009B030801145

摘要/Abstract

摘要：

背景：对肾移植受者免疫细胞的研究一直是移植外科的研究热点，但国内外缺少对肾移植受者术前全面、系统的免疫检测研究。

目的：探讨肾移植受者术前免疫细胞亚群的比例分布。

方法：纳入准备接受初次活体肾移植受者共15例作实验组；以18-40岁健康志愿者15人作对照组，分别抽取外周静脉血进行流式细胞检测。

结果与结论：T细胞亚群：肾移植受者CD4⁺CD25⁺T细胞占外周血淋巴细胞的比例、CD4⁺CD25⁺T细胞占CD4⁺T细胞的比例均低于健康人群，差异有显著性意义(P < 0.05)，其余细胞亚群比例差异无显著性意义。B细胞亚群：肾移植受者CD19⁺/淋巴细胞、CD19⁺CD5⁺/淋巴细胞、CD19⁺CD27⁺/淋巴细胞均低于健康者，而CD38⁺IgD^-/CD19⁺高于健康者，差异有显著性意义(P < 0.05)，其他B细胞亚群比较差异无显著性意义。NK及NKT细胞亚群的比较：肾移植受者NKG2A/NK细胞、NKG2A/NKG2D均低于健康者、而NKG2D/细胞显著高于健康者(P < 0.05)，NK/淋巴细胞、NKT/淋巴细胞差异无显著性意义。说明肾移植受者移植前进行免疫细胞亚群流式分析，可以了解受者移植前免疫状态，对移植后免疫监测起基础对照作用。

关键词: 器官移植, 肾移植, 尿毒症, 免疫细胞亚群, 移植免疫, 免疫检测, 移植排斥, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: The immune cells of renal allograft recipients have always been the hot spot of research. However, there are few studies addressing the immune cell subsets in renal allograft recipients before operation.

OBJECTIVE: To investigate the proportional distribution of immune cell subsets in renal allograft recipients before operation.

METHODS: Fifteen de novo living-related renal transplant recipients were enrolled in this study with 15 healthy volunteers, aged 18-40 years, as healthy controls. Flow cytometry was employed to observe the proportion of the immune cell subsets by extracting peripheral venous blood of all participants.

RESULTS AND CONCLUSION: In the renal allograft recipients, the proportions of CD4⁺CD25⁺ T cells, the proportion of CD4⁺CD25⁺/CD4⁺ T cells, CD19⁺ B cells, CD19⁺CD5⁺ B cells, CD19⁺CD27⁺ B cells, NKG2A/NK cells, and NKG2A/NKG2 cells were all lower than those in the healthy controls; however, the proportion of CD38⁺IgD^-/CD19⁺ B cells and NKG2D cells were higher than those in the healthy controls. The difference of the proportion of immune cell subsets aforementioned between the two groups was statistically significant (P < 0.05), while no difference was observed in other subsets. Immune cell subsets in renal allograft recipients before operation could be used to assess the immune status of the recipients, and also could be seen as the basal control for postoperative immunological monitoring.

Key words: kidney transplantation, uremia, immunity, cellular, autoimmunity, flow cytometry, lymphocytes

中图分类号:

R617

黎东伟，刘龙山，费继光，王长希. 肾移植受者移植前免疫细胞亚群的检测及意义[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(44): 7675-7680.

Li Dong-wei, Liu Long-shan, Fei Ji-guang, Wang Chang-xi . Detection of immune cell subsets in renal allograft recipients before operation and its significance[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(44): 7675-7680.

图/表（结果） 6

参考文献

引言

材料方法

设计：病例对照、前瞻性研究。

时间及地点：病例来自2011年5月至2012年5月中山大学附属第一医院器官移植中心。

对象：中山大学附属第一医院器官移植中心准备接受初次活体肾移植受者共15例，其中男10例，女5例；年龄18-40岁(30.3±7.6)岁；原发病为慢性肾小球肾炎；移植前血肌酐800-1 200 μmol/L；移植前未接受免疫诱导治疗方案；PRA阴性；移植前无活动性感染。以健康志愿者15例作对照组，其中男10例，女5例；年龄18-40岁(28.7±6.6)岁。实验得到中山大学附属第一医院医学伦理委员会的批准, 所有患者及志愿者均签署知情同意书。

材料：

流式抗体：

其他试剂及耗材：由实验室配制，红细胞裂解液(配方：NH₄Cl 8.29 g+KHCO₃ 1 g或NaHCO₃0.84 g+Na₂EDTA 37.2 mg+超纯水至1 L，调pH值到7.2-7.4)，PBS(配方：PBS磷酸盐缓冲剂1包+蒸馏水2 L)，FBS (配方：FBS磷酸盐缓冲剂1包+蒸馏水2 L+叠氮化钠1 g+牛胎蛋白2 g)，移液枪，枪头，流式管，EP管，肝素钠抗凝管，BD FACSCalibur流式细胞仪。

方法：

实验步骤：①抽取肝素抗凝外周静脉血2 mL。②2 mL全血采用红细胞裂解液裂解红细胞，按照1∶5体积，裂解10 min。③裂解后用PBS离心洗涤2遍，每次1 500 r/min，5 min。④采用FBS冲旋至一定体积，根据检测细胞亚群数量分装至EP管，每管体积100 µL。⑤采用直接免疫荧光标记法。每管中加入所需的流式抗体，4 ℃孵育30 min，用FBS离心洗涤2遍(每次 1 500 r/min，5 min)，冲旋至300-400 µL，上机检测。⑥流式分析软件采用CellQuest Pro。

主要观察指标：分析各免疫细胞亚群比例分布，包括T细胞、B细胞及NK细胞。

统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，两组计量资料间比较采用t 检验或Mann-Whitney非参数U 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

T淋巴细胞简称T细胞，外周血中T细胞占淋巴细胞总数的65%-70%，其主要功能是介导细胞免疫、调节机体的免疫功能。T淋巴细胞有两个主要亚群，辅助性 T淋巴细胞(CD4⁺)和抑制性T淋巴细胞(CD8⁺)。机体内的细胞免疫平衡主要由这两大类细胞相互影响来维持, 一般认为CD4可辅助细胞产生抗体及分泌一些细胞因子, 具有调节增强免疫反应的作用；CD8细胞具有免疫抑制作用和细胞毒作用^[4-5]。CD25是白细胞介素2的受者，CD25^-T细胞经抗原刺激后活化，合成和分泌白细胞介素2，向CD25⁺T细胞转变^[6-8]。实验研究发现，两组比较，CD4⁺、CD8⁺亚群未见明显差异，但肾移植受者CD4⁺CD25⁺T细胞比例低于健康者，而CD25是T淋巴细胞活化的标志之一，CD4⁺CD25⁺/CD4⁺常表示CD4⁺T细胞亚群的活化水平，这提示实验肾移植受者体内CD4⁺T细胞活化水平比健康者低。CD4⁺CD25⁺T细胞可分为CD25⁺调节性T细胞和CD25⁺激活T淋巴细胞，CD127的表达常可用于区分上述两亚群，可代替Foxp3用于人外周CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的鉴定^[9-11]，而两组的调节性T细胞比例无明显的差异，因此实验考虑两组CD4⁺CD25⁺T细胞亚群的差异主要是CD25⁺激活T淋巴细胞的差异。CD69又称活化诱导分子，是T淋巴细胞激活后最早表达的表面抗原,当其表达后，可作为共刺激信号促进T细胞进一步活化和增殖^[12-13]。在CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T亚群中，肾移植受者与健康者CD69的表达水平均无明显差异。 B细胞分为两个主要亚群：B1细胞和B2细胞。B2细胞即通常所指B细胞，介导体液免疫，而B1细胞是一种长寿的，具有自我更新能力的B细胞亚型，能够产生大量的多反应性低亲和力IgM，介导固有免疫反应，能识别多种细菌表面抗原及某些自身抗原，产生抗体，对于细菌或者病毒感染的早期反应起到非常重要的作用^[14-16]。实验结果显示：准备接受肾移植受者的CD19⁺B细胞、CD19⁺CD5⁺B细胞以及CD19⁺CD27⁺B细胞占淋巴细胞比例明显低于健康者，与国外文献报道相似^[17]，但CD19⁺CD5⁺B细胞、CD19⁺CD27⁺B细胞占CD19⁺B细胞的比例差异无显著性意义，这提示肾移植受者B细胞占淋巴细胞比例虽低于健康者，但在B细胞内CD19⁺CD5⁺及CD19⁺CD27⁺的比例分布与健康者相似。Baff-R反映B细胞活化水平^[18-20]，研究显示两组差异无显著性意义，表明肾移植受者B细胞活化水平与健康者基本相同。以CD19、CD38、IgD、CD27等区分的B细胞亚群，代表着不同发育阶段的B细胞亚群^[21]：原始B细胞(Bm1：CD38^-IgD⁺)；激活的原始B细胞(Bm2: CD38⁺IgD⁺)；前生发中心细胞(Bm2`：CD38⁺⁺IgD⁺)；生发中心细胞(Bm3和Bm4：CD38⁺⁺IgD^-)；早期记忆性B细胞(early Bm5：CD38⁺IgD^-)；记忆性B细胞(Bm5; CD38^-IgD^-)。研究结果显示：受者CD38⁺IgD^-细胞群高于健康者，其余亚群比较则与健康者大致相同。 NK细胞是一种属于淋巴细胞谱系的细胞群，具有细胞毒效应，无需抗原预先致敏就能自发的杀伤靶细胞，有杀伤肿瘤细胞、病毒感染的细胞、胞内寄生菌、真菌等功能，在肿瘤免疫、抗病毒免疫及固有免疫中均起重要作用。NKG2A为NK细胞的抑制性受者，NKG2D为激活性受者^[22-24]。NK细胞比例两组比较差异无显著性意义，但受者NKG2A/NK细胞、NKG2A/NKG2D比例明显低于健康者，而NKG2D/NK细胞比例明显高于健康者，说明受者NK细胞的抑制功能低于健康者，而活化功能高于健康者。 NKT细胞是固有类淋巴细胞，具有免疫调节和细胞毒作用^[25]。NKT细胞的功能与其激活后分泌的细胞因子密切相关，NKT细胞通过分泌白细胞介素4和γ干扰素调节Th细胞的分化，并且通过激活细胞毒效应细胞在天然免疫和后天免疫中发挥重要作用。Th1/Th2之间的平衡是由白细胞介素4和白细胞介素12/γ干扰素决定的，而NKT细胞正是通过产生白细胞介素4和γ干扰素调节免疫应答的^[26]。NKT细胞在激活之后的3 h即发生凋亡，所以最终的效应细胞不是NKT细胞，而是NK细胞及其他细胞。实验研究结果显示，肾移植受者NKT细胞比例与健康者基本相同。通过对肾移植受者移植前进行免疫细胞亚群流式分析，可以了解受者移植前免疫状态，对移植前等待手术时的治疗有指导作用，对移植后免疫监测起基础对照作用，对选择移植前免疫诱导用药方案及移植后免疫抑制用药方案也有一定的参考价值。

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